2021年，經濟合作（zuò）與發展組織（OECD）正式發布（bù）了一項具（jù）有裏程碑意義（yì）的測試（shì）指南——第497號（TG 497），首次將一套完整的綜合體外測試方案納入國際毒理學評價體係，該方案用於化學品的皮膚致敏性評估，被視為可完全替代動物實驗。緊接著，OECD於2022年又發布了（le）另一項綜合體外測試方案TG 467，用於評估眼部腐蝕與刺激。盡管目前僅有這兩項指南作為完全替代（dài）相應動（dòng）物實（shí）驗的方案被納入官方毒理測試評價體係，但它們的推出仍標誌著在部分領域，非動物方法已由“輔（fǔ）助性工具”躍（yuè）升為決策層麵（miàn）的（de）主導手（shǒu）段，實現了特定毒理終點的完全替代（dài）。但正（zhèng）如TG 497的成功案例所揭示的那樣，實（shí）現（xiàn）“完全（quán）替代”的道（dào）路並非坦途——每一個被采納（nà）的替代方案都需要（yào）在對生物機（jī）製深入（rù）理解的基礎（chǔ）上，實現方法的標準化、完成多中心驗證及確保替代方案與人體（tǐ）真實反應的高度一致性。因此，目前替代成功更多是個別突破（pò）而非普遍現象。在了解TG 497前，先簡要了解（jiě）下皮膚（fū）致敏的過（guò）程和機理（lǐ）：化合物引發皮膚致敏反應主要涉及三個連續的生物學過程。

首先，多（duō）數低分子質量（通常小（xiǎo）於500道爾頓）的（de）化學（xué）物質本身（shēn）不能被免疫（yì）係統直接識別，因此它們需首先與皮膚中的蛋白質發生共價結合（hé），形成所謂的半抗原複合（hé）物。這種修飾後的蛋白質結構被免疫係（xì）統識別（bié）為“外來”，成為真（zhēn）正（zhèng）具有免疫原性的抗原，進而（ér）觸發遲發型（IV型）變態反應，即皮膚致敏反應的起（qǐ）點；

第二（èr）步是角質形成細（xì）胞的（de）應激激（jī）活。在接觸化學物質後，表皮中的角質形成細胞會（huì）被（bèi）刺激而激（jī）活，釋放一係列促炎因子，如各種白細胞介素和胸腺基質（zhì）淋（lín）巴細（xì）胞生（shēng）成素等。這些（xiē）細胞（bāo）因子的（de）釋放不僅增強局部炎症反應，還具有重要（yào）的免疫（yì）信號功能，可吸引並激（jī）活樹（shù）突狀細胞及朗格（gé）漢斯細胞向接觸部位遷移；

第三步是樹突狀細胞（bāo）的激活與抗原提呈。這些抗原遞呈細胞在接（jiē）觸刺激部（bù）位攝取半（bàn）抗原複合（hé）物後，成熟並遷（qiān）移（yí）至區域性淋巴結，在那裏與T細胞相互作用，完成（chéng）抗（kàng）原提呈，最終形成免疫記憶。該免疫記憶使（shǐ）得個體在後續暴露相同化學物質時迅速出現（xiàn）過敏反應，表現為（wéi）典型（xíng）的過（guò）敏性接觸性皮炎。

從皮膚（fū）首次接觸某種化學物質，到反複暴露後誘發過敏性接觸性皮炎的全過程，在現代（dài）毒理學中被統稱為“有害結局通路（lù）”。該通路由多（duō）個生物學過程構成，其中的關鍵環節（jiē）被稱為“關鍵事件”。由上文可知（zhī），皮膚致敏的有害結局通路包含三（sān）個關鍵（jiàn）事件，即（1）半抗原形成；（2）角質形（xíng）成細胞的激活和（3）樹突狀細胞激活。在所有已知的“有害（hài）結局通路”中，皮膚致敏性“有害結局通路”是建立最早、機製（zhì）最明確，且相對容易進（jìn）行體（tǐ）外模擬的免疫反（fǎn）應，因此成為了替代方法開發的突破口。

在傳統毒理學評估中，皮膚致敏性通常依賴動物整體反應模型進行判斷，代（dài）表性方法包括：（1）豚鼠皮膚致敏試驗，用於綜合評（píng）估致敏起始階段與激發階段的反（fǎn）應；（2）局部淋巴結（jié）試驗，聚焦於皮膚致敏階段。以局部淋巴結試（shì）驗為例，一次標準實驗需消耗至少20隻小鼠。據（jù）統計，截至2018年，僅在歐盟REACH製度實施框架（jià）下（xià）就已有超過33,000隻小鼠被（bèi）用於皮膚致（zhì）敏性測試。

那麽TG 497中所列的動物替代技術是如何實現的呢？TG 497 所采（cǎi）用的“三選二策略”是（shì）基於皮膚致敏性有害結局通路中的前三個（gè）關（guān）鍵事件所構建的一種綜合（hé）性評估（gū）方（fāng）法，旨在判定受試化學物是否具有皮膚致敏潛力。

首先，直（zhí）接肽反應實驗（DPRA，OECD TG 442C）用於（yú）評估第一關鍵事件，即被測物是否具有（yǒu）與蛋（dàn）白質共價結合形成半抗（kàng）原的能力。該方法采用合成的含半胱氨酸或賴氨酸殘基的肽（tài）段作為模型受體，與被測物共同孵育後，通過測量肽的消耗率評估其反應性。反應結（jié）束後，利用高效液相色譜對肽段（duàn）殘留量進行定量分析。若肽的消耗顯著（zhe），說明化（huà）學物能與肽發（fā）生共價反應，具備潛在致敏性，從而完成對半抗原形成關（guān）鍵事件的評價。

其次，角質形成細胞激活試（shì）驗（KeratinoSens™, OECD TG 442D）用於評估（gū）第二關鍵事件——角質形（xíng）成（chéng）細胞的氧化應激與促炎反應激活，該事件在有害結局通路中處於信號放大的早期（qī）階段（duàn）。KeratinoSens™方法基於轉基因人永生化角質形成細胞係HaCaT，該細胞穩定表達（dá）一個由（yóu）抗氧化反應元件驅動的（de）熒光素（sù）酶報告基因。當潛在（zài）致敏物（wù）質刺激角質形成細胞時，會引發細胞內應激響應（yīng），從而啟動熒光素酶表達。通過測定熒光素酶活性，即可定量（liàng）評估化學物對該通路的（de）激活能力，進而判斷其是否誘導角質形成細胞釋放促炎（yán）因子。

最後，人源樹突狀細胞活化實驗（h-CLAT，OECD TG 442E）模擬有害結（jié）局通路中的第三關鍵事件（jiàn）——樹突狀細胞的激（jī）活。在致敏過程中，被測物通過局部炎症（zhèng）信號激活樹突狀細胞，後者在抗原識別、處理及（jí）向T細（xì）胞提呈抗原的過程中起到橋梁作用。h-CLAT方法使（shǐ）用人急性單核細胞白血病細胞（bāo）係THP-1作為樹（shù）突狀細胞的替代模型。當致敏化學物作用於THP-1細胞後，若具免疫激活能力（lì），將誘導（dǎo）其表麵共刺激分子（如CD86和（hé）CD54）表達上調（diào）。通過流式細胞分（fèn）析檢測這些表麵標誌物的相對熒光強度變化，即（jí）可判斷化學物是否具備激活免疫係統的潛能（néng）。

TG 497通（tōng）過整合上述（shù）三種機製互補的體外方（fāng）法，從生物學不同層麵綜合評估皮膚致敏性。隻要任意兩項測試（shì）結果一致，即可做出科學、可靠的致敏性判斷（duàn），從而實現（xiàn）在此毒理（lǐ）終點上對動物實驗的完全替代。這三項方法各自針對皮膚致敏有害結局通路中的（de）不同關鍵節點，組合使用時增強了判斷的穩健性和預測一致性。

TG 497被正式寫入OECD指南前（qián），其開發團隊以及歐盟替代方法驗證中心、美國替代方法驗證協調（diào）委員會（huì）和日本替代方（fāng）法驗證中心都對其評估能力進行了驗證，並與傳統動物實驗（yàn）方（fāng）法如局部淋巴結（jié）試驗（yàn）做了對（duì）比，結果顯示TG 497在多個核心指標上全麵優於局部淋巴結試驗。具體（tǐ）表現為：在敏感（gǎn）性上，TG 497達到了87%，相比之下（xià）局部淋巴結試驗為72%，證明前者在識別真正致敏物方麵表現更優；在特（tè）異性方麵，TG 497為88%，也明顯高於局部淋巴結試（shì）驗的75%，證明其在排除非致敏物時（shí）誤判更少；在準確率上，TG 497為87.5%，也高於局部（bù）淋巴結試驗的73%，證（zhèng）明其在整體預測效（xiào）能（néng）上表現更加平（píng）衡；更為關鍵的是，與人體不良反應數據的一致性上（shàng）TG 497達到了“非常高”，而（ér）局部（bù）淋巴結試驗僅為“中等（děng）偏高”，這表明TG 497在臨床（chuáng）相關性上更（gèng）具優勢。

綜上所述，TG 497不僅在科學性能上更為出色（sè），而且（qiě）由於其不依賴動物實驗、與（yǔ）人體數（shù）據一致性更高，因此得（dé）以成為目前首個被國（guó）際監管（guǎn）機構OECD采納的完全替代皮膚致敏性（xìng）動物（wù）試驗的（de）標準（zhǔn）體（tǐ）外測試方案。這一（yī）指南的頒布也標誌著（zhe）毒理學替代方（fāng）法從“輔助”邁入“決策（cè）級”應用（yòng）的關鍵進展。

盡管TG 497的成功被視（shì）為替（tì）代毒理學領域的重要裏程碑，但其背後反映出的研發過程也暴露了動物替代（dài）方（fāng）法開發的諸多難點與局限。之所以能取得突破，首先因為皮（pí）膚致敏（mǐn）反應是目前有害結局通路建立最完善的毒理路徑之一，機製（zhì）簡單、事件明確、模擬容（róng）易（yì）。相比之下，神經（jīng）毒性、免疫毒（dú）性、內分（fèn）泌幹擾等終點路徑複雜，機製不明確，至今尚無可實現完全替代的（de）體外組合方法。其（qí）次，TG 497研發成功的（de）核心優勢還在於擁有有大量來自因斑貼（tiē）測試、臨床案例和職業暴露的人體皮膚致敏不良反應數（shù）據可用於方法驗證。而多數其它毒理領域仍嚴重依賴（lài）於動物實驗數據，缺乏可比對的人體資料，從而限（xiàn）製了相應替代方案的實（shí）際驗證（zhèng）路徑。即便如此，TG 497成功進入OECD指南也曆經了漫長的驗證、標準化與互認過程。三項（xiàng）子方法最早提（tí）出可追溯至2006年（nián）前後，但直至2015年才以單獨測試方（fāng）法形式被 OECD 采納，2021年方整合為 TG497——整個流程耗時（shí）逾（yú）10年。

此外TG 497在（zài）皮膚致敏評估中仍存在化學（xué）品適用範圍的盲區：它僅適用於（yú）小分子化學品，對金屬離子、複雜混（hún）合物、親水性或高反應性物質尚不適用；同（tóng）時，也不適（shì）用於易幹（gàn）擾測試係統穩定性的強（qiáng）刺激（jī）性或腐蝕性化合物。

可以說，TG497 的誕生既是一道分水嶺，也是一麵鏡子：一方麵，它首次證明“綜合測試方案”完全可以獲得監管層麵（miàn）的認可，為 OECD 體係內其他毒理（lǐ）終點開發類似方法樹立了範式；另一方麵，它警示我們，唯有深入掌握生物機製、係統整合多源數據並實現（xiàn）方法標準化與多（duō）中心驗證，替代策略方能真正（zhèng）落（luò）地。更進一步，TG497 的成功表（biǎo）明，替代路徑更（gèng）適用於機製清晰、易於（yú）體外模（mó）擬且（qiě）人體數據相對（duì）充足的毒（dú）理終點。總之，替代（dài）並非簡化，不是單憑熱情就可以“一（yī）蹴而就”的，而是在更高科學規範要（yào）求下，通過（guò）持續演化與完善（shàn）才能（néng）夠得以實現；同時，其研（yán）發仍離不開動物實驗與人體反應數據（jù）的對照與支撐。因（yīn）此，盡管TG497 為全麵替代動物實驗開了一個好頭，但在所有領域都實現這一目標仍有漫長的科學探索與（yǔ）製（zhì）度建設之路要走。