滴眼給藥毒性試驗的目的（de）

滴眼給（gěi）藥毒性試驗是重複給藥一（yī）般（bān）毒性試驗，主要（yào）用於研發滴眼藥物。歐盟發布的《醫療用品非臨床（chuáng）局部耐受性試驗指（zhǐ）導（dǎo）原則》（CPMP/SWP, 2001）明確規定了單次給藥和重複給藥眼部耐受性試驗的（de）相關事宜。美國食品（pǐn）藥品（pǐn）監督（dū）管理（lǐ）局發（fā）布的《藥品以及可替代性給藥藥品非臨床安全性（xìng）評價指導原則草案》（FDA/CDER, 2008）則明確要求在滴眼給（gěi）藥（yào）時應開展係統藥代動力學（PK）和眼科檢查（包（bāo）括（kuò）裂（liè）隙燈（dēng）顯微鏡檢查、眼底檢查、眼壓測量及組織（zhī）病理學檢查）。然而，這兩份指導（dǎo）原則中的相關規定均（jun1）較簡要，缺乏滴眼給藥毒（dú）性試驗詳細設計的具體（tǐ）內容（róng）。目前，尚無滴眼給藥毒性試驗的確切定義。日本（衛生福利部，1999）依據ICH M3指導原則（ICH, 2009）和ICH S4指導原則開展滴（dī）眼給藥毒性試驗。這些原則（zé）通常適用於係統給藥的藥物。

有人常常將滴眼給藥毒性試驗與眼（yǎn）刺激試驗混為一（yī）談（tán）。實際上，滴眼毒性預試（shì）驗、一周或兩周的重複給藥滴眼（yǎn）毒性試驗（yàn）的方案與眼刺（cì）激試驗的方案有相似之處（OECD, 2012）。

目（mù）前，眼刺激試驗通（tōng）常使用（yòng）兔（tù）子進行，以評估化學物質在粘膜給藥或人體偶然接觸時（shí）的安（ān）全性（OECD, 2012）。眼刺激（jī）試驗的主要目的是檢測眼表的刺激或（huò）腐蝕反應。

相比（bǐ）之下，滴眼給（gěi）藥毒性試驗的主要目的是評估眼科藥物的一般毒性。因（yīn）此，滴眼給（gěi）藥毒性試驗（yàn）的（de）檢查項目包（bāo）括組織病理學檢查（chá）、眼部附屬器以及全身髒器的（de）評價。這兩種試驗的差異見表1。

表1 滴（dī）眼給藥毒性試驗和眼刺激試（shì）驗的差（chà）異

滴眼給藥毒性試驗的設計

01、動物物種

根據ICH M3指導原（yuán）則，一般毒（dú）性試驗需（xū）選擇兩種動物（ICH, 2009）。通常情況下，會從齧齒類動物（如兔或小鼠）和非（fēi）齧（niè）齒類動物（犬或猴）中各選一種。然而，在（zài）過（guò）去十年間（2005~2016），經日本衛（wèi）生勞動福利部（MHLW）批準，約（yuē）九成的滴眼液在研發過程中，將兔作（zuò）為開展滴眼給藥毒性試驗的首選實驗物種（zhǒng），其次常用的實驗物種是猴（幾乎全部是食蟹猴），再然後是犬（見表2）。因此，滴眼給藥毒（dú）性試驗通常選擇兩種非齧齒類動物。不過，動物物種的（de）選擇（zé）是（shì）根據具體情況而定（dìng）的。因此，在評估某些藥（yào）物時，可能僅使用一個（gè）物種（比如兔或食蟹（xiè）猴）。

表2 2005~2016日本滴眼液滴（dī）眼給藥毒（dú）性試驗的獲批的動物物（wù）種 

注：信息來源於日本（běn）醫藥和醫療器械局（PMDA）主頁

近來（lái）發表的多篇文章從眼部（bù）安全性評估的角度出發，討論了各個實驗物種的特點，並對不同實驗物種作了比較。各物種的特點如下。

兔

兔的眼球重量（liàng）約為人眼的一半，眨眼（yǎn）頻率（每6分鍾一次（cì））明（míng）顯低於人（rén）類的眨眼頻率（每5秒鍾一次）。此外，兔的角（jiǎo）膜比人類的角膜薄。基於這些特點，並考慮到影（yǐng）響（xiǎng）藥物角（jiǎo）膜滲透能力的因素，有研究者預計，在滴入滴眼液後，兔眼的藥物暴露水平相對較高。McDonald和Shadduck（1977）認為兔相較於其（qí）他（tā）實驗動物對眼刺激物更為敏（mǐn）感。使用兔（tù）進行試驗的其他原因還包（bāo）括較低的動物成（chéng）本以及基於大量供試品積累的曆史數據。

在進行滴眼給藥毒（dú）性試驗（yàn）時，特（tè）別需注意選擇色素兔還是白化兔。由於供試品能夠與色素兔（tù）體內的色素結合，因此在毒性評估（gū）時，色素兔更具優勢。關於色素兔，荷蘭帶兔比新西（xī）蘭（lán）大白兔和新西蘭紅兔（F1代兔）更常用於滴（dī）眼給藥毒性試驗。Durairaj等人（2012）報告稱，人、食蟹猴、犬、豬、F1代兔和荷蘭帶兔的眼部黑色素含量存在差異，而且不同（tóng）物種之間眼睛各部分的黑（hēi）色素含量也不同。另外，值得（dé）一提的是，荷蘭帶兔的眼球比新西蘭大白兔或日本（běn）白兔（tù）的（de）小。

猴

盡管食蟹猴的眼球重量僅約為人眼（yǎn）的一半，但其解剖特征與人類相似。例如，食蟹猴（hóu）的角膜和晶狀體相對較（jiào）小，眼底有黃斑。Shibuya等（děng）人（2015）建議將食蟹猴用作實驗動物，因為（wéi）它們的眼睛有助於詳細評估藥物誘導的黃斑（bān）病（bìng）變毒（dú）性。食蟹猴的眨眼頻率與人類相似。與人類（lèi）一樣，食蟹猴既沒有瞬（shùn）膜，也沒有哈氏腺，而兔、犬和豬則都有瞬膜（mó）和哈氏腺。食蟹猴和犬一樣（yàng），也用於係統毒性試驗。利用（yòng）相關物種可以獲得毒理學數據，彌合局部給藥和係統給藥在同一物種中產生的結果差異。與人（rén）類相比，食蟹猴的眼組織黑色素（sù）含量相對較高。在猴類中，視神經退化常見於恒河猴和食蟹猴，且（qiě）被認為是自發性先天視神經病變。

犬和豬

針對特定目的飼養的比格犬的眼球重量約為5.5克，約為人（rén）眼重量的0.8倍，而（ér）豬的眼（yǎn）球大小接近人眼。從眼球的絕對尺寸來看，犬和豬在藥（yào）物局部效（xiào）應評估（gū）方麵（miàn）具有優勢，因為眼組織的厚度和（hé）長度是（shì）決定局部給藥藥物滲透（tòu）性和分布的重要因素。犬和豬（zhū）的眼部解剖特征相似，例如（rú），與靈長類動物相比，它們（men）的晶狀體在眼球中占據的體積相對較大。另一方麵，犬的（de）脈絡膜上有毯氈層（céng），而豬、兔或食蟹猴則沒有。目前，犬和豬不常用於滴眼給藥毒（dú）性（xìng）試驗，尤其是豬。然而，這類動（dòng）物在滴眼給藥毒性（xìng）試驗中（zhōng）仍有其獨特的優勢，理由如下：1. 基於上（shàng）述解剖和生（shēng）理特點，模仿人體藥物分布的可能性較高。2. 與兔和（hé）食蟹猴相比，由於犬（quǎn）和豬的（de）體型相對較大，通過（guò）係統給藥出現（xiàn）的藥物反應更少。

02、性別

根據一般毒性試驗指導原則（衛生福利部，1999），滴（dī）眼給藥毒性試驗應在兩種性別的動（dòng）物（wù）上進行。人類、恒（héng）河（hé）猴和兔的眼軸長度存在性（xìng）別差異，但眼球尺寸的性別差異卻極其微小。Wagner等人（2008）研究了健康人眼和患病人眼的性（xìng）別差異，認為性激素影響了不同性別在患病狀態下的淚（lèi）腺係統、眼瞼和眨眼頻率、以及角膜的解剖和特征。一般（bān）而言，幹眼流行病學研究表明女性幹眼發病率比（bǐ）男性（xìng）高。然而，實驗（yàn）動物的眼睛是否存在顯著的性別差異尚不明確。是否在滴眼給藥毒性試驗中（zhōng）使用兩種性別，尤其（qí）僅進行（háng）眼毒性評估的（de）試驗，仍有待進一步討論。

03、給藥

劑量和濃度

根據ICH M3指導（dǎo）原則（ICH，2009），一般毒性（xìng）試驗的高（gāo）劑量水（shuǐ）平設定為最大耐受量（MTD）、最大（dà）給藥量（liàng）（MFD）或人體暴露量的50倍。這一設定原則同樣（yàng）適用於滴眼給藥毒性（xìng）試驗。在某些情況下，高劑量水（shuǐ）平可以基於局部耐受性預試驗的結果來確定。然而，在大多數情（qíng）況下，滴眼給藥毒性試驗（yàn）的高劑量水平是根據MFD設定的，主要是（shì）由於（yú）製劑製備的某些內在因素。

供試品（pǐn）的角膜滲透性主要取決於製劑的特（tè）性。為了獲得有意義的風險評估結果，權威性（xìng）滴眼給藥毒性試（shì）驗（例如首次人體試驗之前開展的GLP試驗）所用的供試（shì）製劑應與臨床試驗所用的製劑一致或（huò）相近。供試品的濃（nóng）度主要是根據其在製劑中的溶解度來定義的（de）。至於製劑的調（diào）整，其他（tā）特性（如滲透壓（yā）、pH值和賦形劑）也十分重要。滴眼液製劑的酸堿度應在可接受的（de）生理範圍內。選擇防腐劑時，需避免其濃度達到（dào）引起毒性反應的水（shuǐ）平。例如，有研究者發現，眼科製（zhì）劑中常用的防腐（fǔ）劑苯紮氯銨在局部（bù）給（gěi）藥時會誘發角膜變化。因此，眼科製（zhì）劑中防腐劑的濃度是（shì）有限製的。因此，在大多數情況下，滴眼給藥毒性試驗所設的最高劑（jì）量水平（píng）是基於受試製劑的最大（dà）給藥量，而非供試品本身的特性來決定的（de）。

滴眼（yǎn）體積

兔子的眼瞼較為（wéi）鬆弛，結膜囊較大，因此能容納較大的滴眼液體積。根據OECD眼刺激試驗指導原（yuán）則，兔子（zǐ）的滴眼體積為0.1 mL（OECD, 2012）。該（gāi）體積約為臨床標準滴眼液用藥體積（約0.04 mL）的兩倍。從經驗來看，不同物種的最大滴眼體積並（bìng）不相同。例如，比格犬和兔子的最大可行體積相似，而食蟹猴的最大可行（háng）體積（jī）則是比格犬和（hé）兔子的兩倍多。

需注意的是，眼部暴露量並不會隨著滴眼體積的增加而（ér）成比例增加，因為部分多餘的液體會通過鼻淚管流失。Lambert等（1993）假定在眼刺激試驗中，如果滴眼體積為0.01 mL（建議供試（shì）體積的（de）十（shí）分之一），藥物與人眼刺激感受的相關性（xìng）更佳。因此，滴眼給藥毒性（xìng）試驗的滴眼體積可能需進一步討論。增加滴眼體積並不能有效提高眼部暴露量，反而可能導致係統暴露量增加，甚至引發（fā）意料之外的係統（tǒng）毒性反應。

單眼/雙眼給藥

供（gòng）試品是單（dān）眼給藥還是雙（shuāng）眼給藥需慎重考（kǎo）慮。從動物福利的角度出發，若無特殊原因，應將供（gòng）試品滴入單側（cè）眼睛。如一隻眼給予供試品，另一隻（zhī）眼則（zé）不給藥（即不（bú）接觸供試品（pǐn）），或給予對照品（例如溶媒製劑）作為對照。然而，嚴格來說，對照眼由於（yú）係統循環的影響，可能也會接觸到供試品（pǐn）。因此，在評估對照眼的結果（guǒ）時，應該考慮到這一潛在的接觸因素。

給藥頻率

在標準的口服（fú）或靜脈給藥（yào）一般毒性試驗中，通常每天給藥一次；而在滴眼給藥毒性試驗中，通常一天給藥多次。非臨床試驗（yàn）的滴眼頻率（lǜ）通常高於臨床試驗的給藥頻率。例如（rú），非臨床試驗中可能每天滴眼4次，而臨床試驗中則每天滴眼2次。滴眼給藥毒性試驗設（shè）定較高的給藥頻（pín）率，旨在獲得更高的重複暴（bào）露量，特別是在供試品（pǐn）的（de）生化特征導致最大藥物濃度難以增加時更為重要。Chrai等人（1974）報告稱，如（rú）果（guǒ）兩次（cì）滴眼間隔5分鍾，就能有效地（dì）增加兔的眼部暴露（lù）量。許多滴眼給（gěi）藥毒性試驗的（de）給藥（yào）頻率是臨床給藥頻率的1.5到2倍。然而，給藥過於頻（pín）繁雖可（kě）提（tí）高暴露水平，但也增加操作的（de）次數，從（cóng）而增加動物保定的頻率，這可能導致動（dòng）物應（yīng）激（jī），進而引發倫理問題。因此，在設計滴眼給藥毒性試驗時，需在提高暴露水平和（hé）減少動（dòng）物應激之間找到（dào）平衡點，以確（què）保試驗的科學（xué）性和倫理性。

04、眼及附屬組織檢（jiǎn）查

常規/標準眼（yǎn）科學檢查

滴眼給藥毒性試驗目前尚無統一的（de）眼部和係統（tǒng）檢查項目。OITSs的眼科（kē）學檢（jiǎn）查是基於（yú）係統藥物一般毒性（xìng）評估指導原則進行的，涵蓋了眼前節、眼內介質和眼底等所有組織的檢查（ICH, 1999）。然而（ér），由於滴眼給藥直接作用於（yú）眼部，滴（dī）眼給藥毒性（xìng）試驗的眼科學檢查更加詳細，涵（hán）蓋的檢查項目也更多。Weir和Wilson（2013）列出了非臨（lín）床眼毒性（xìng）試驗的標準眼部安全性終點，這些終點（diǎn）具有重要的借鑒意義。檢查項目（mù）包括：大體（tǐ）觀察、裂隙燈生物顯微鏡檢查、眼底檢眼（yǎn）鏡檢查、眼壓測量、視網膜電圖和組織病（bìng）理學。

基於相關指導原則（zé）和知識，表（biǎo）3總結了滴眼給藥毒性試驗的常（cháng）規及（jí）可選眼科檢（jiǎn）查項目。由於眼前節的供試品（pǐn）濃度較高，因此對眼前節進行觀察和檢查尤為重要。除標準的大體（tǐ）觀察外，采用評分方法進行詳細觀察對（duì）於評估眼毒性的嚴重程（chéng）度非常關鍵。例如（rú），Draize評（píng）分法用（yòng）於角膜、虹膜和結膜的大體觀察。McDonald Schadduck評分和Hackett-McDonald評分常應用於滴眼給藥毒性試驗中，二者對裂隙燈顯微鏡檢查結果進行評分。特別是，Hackett-McDonald評分能對眼睛進行全麵評估，包括對晶體和瞳（tóng）孔光反（fǎn）射的評估。

表3 滴（dī）眼給藥毒性試驗的常規或可（kě）選眼科學檢查

常規檢（jiǎn）查包（bāo）括利用檢眼（yǎn）鏡對玻璃體和眼底進行觀察。使用直接檢眼（yǎn）鏡和間接檢眼（yǎn）鏡可詳細檢查眼底（dǐ）。本原（yuán）則（zé）建議，除拍（pāi）照外，還應簡述檢查（chá）結果並記錄，並將這些記（jì）錄與相應的詳細記錄一同保存。

眼壓是衡量前房角功（gōng）能變化的重要參數（shù）。FDA指導原則提（tí）到了使用眼壓（yā）計（jì）的（de）方法（FDA/CDER，2008）。在非臨床（chuáng）毒性試驗（yàn）中，常用扁平眼壓計、回（huí）彈式眼壓計或空氣（qì）式眼壓計來測量眼壓。在滴眼給藥毒性試驗中，使用眼壓計有幾點注意事項。首先，為了獲得（dé）準確的眼壓值，有必要使動物適應眼壓計。在測量（liàng）之前，如果動（dòng）物沒有適應眼（yǎn）壓計，通常情況下（xià）測出的眼壓值會偏高，從而導致無法正確判（pàn）斷藥效。其次，由於儀器會接觸角膜表麵，眼壓測量操（cāo）作可能會在某種程度上損傷角膜上皮細胞。因此（cǐ），應慎重決定（dìng）檢查（chá）的組別及檢查順序，以避免眼部過度應激，並防止過度（dù）應激影響其他結果的（de）解讀。

通過全視野視網（wǎng）膜電圖檢查（ffERG）可檢測視網膜的功（gōng）能變化。理想的做法是使用國際臨床（chuáng）視覺電生理協會（ISCEV）建議的方法，因為此方法可在進行全視（shì）野視網膜電（diàn）圖檢查時識別視錐細（xì）胞和（hé）視杆細胞的變化。然而，此方法不適用於在有限時間（jiān）內（nèi）對大量動物進行檢查的情況（kuàng）。ISCEV方法擬用於隨診檢查（chá），可能僅適用於ERG檢查發現異常的情況。例如，Penha等人（2010）報告稱，角膜混濁或晶體混濁會影響光線到達視網膜，而麻醉也會影響全視野視網（wǎng）膜電圖的檢查結果。

可選檢查

關於淚膜檢查，Schirmer試驗和酚紅線試驗用於淚液體積的（de）定量分析。進行Schirmer試驗（yàn）和（hé）酚紅線試驗時，分別使用無（wú）毒濾紙或棉線浸潤於pH指示劑酚紅溶液中，然後插入結（jié）膜囊內進行淚膜檢測（cè）。淚膜的其他臨床檢（jiǎn）查包（bāo）括淚膜破裂（liè）時間。此前已有研究（jiū）者報告了（le）犬和兔的淚膜破裂時間，這些測試能夠揭示淚腺的功能狀態。此（cǐ）外，眨眼頻率也可以間接說明供試品是否對（duì）角膜產生了刺激。

由於眼（yǎn）科成像（xiàng）技術的進（jìn）步，現在能檢測出常規眼科學檢查難以察覺的（de）變化。例如，角膜共焦顯微（wēi）鏡（jìng）檢查能夠捕捉到角膜上皮的細微變化；角膜內皮顯（xiǎn）微鏡檢（jiǎn）查能夠觀察到角膜內（nèi）皮的形態和密度（dù）變化；光學相幹斷層掃描（OCT）對於視網膜的觀察（chá）非常有力。這些成像技術（shù）均可（kě）用於（yú）滴眼給藥毒性試驗中的動物檢查（chá），能夠生（shēng）成高分辨率的（de）圖像（xiàng），滿足組織病理（lǐ）學（xué）檢查（chá）的要求（qiú）。

滴眼給藥毒（dú）性試驗的（de）其（qí）他常用眼前節檢查包括定量測量角膜厚度的測厚儀和定量測量前房房水閃輝的激光房水閃光（guāng）細胞儀。如果（guǒ）眼後節的視網膜出現（xiàn）局部異常，多（duō）焦視網膜電（diàn）圖（mfERG）能夠捕捉到相應的電生理信號。利用（yòng）眼底血管熒光造影（yǐng）能夠觀察到視網膜和脈絡膜的原有血管及新生血管的滲透性。

Kontadakis等人（2014）指出，淚膜中的細胞因子和生長因（yīn）子作為生物標記物，能預示眼表疾病。有研究者（zhě）報告稱，血清細胞因子是預示（shì）老年黃斑變性（xìng）的（de）生物標記物。生物標記物能用於非侵入（rù）性（xìng）方式觀察藥物（wù）誘導的眼毒性反應。然而，目前這樣的生物標記物數量仍然有限。反過來，上述的各種眼部成像技術可能可替代生物標記（jì）物，用於觀察和研究人和動物的眼毒性。

05、眼（yǎn）及附屬（shǔ）組織的（de）病理學檢查

組織病理檢查是滴眼給藥毒（dú）性試驗的重要組成部分。最近，多篇文獻綜述一致強調了（le）組織病理學檢查在藥（yào）物評估中的（de）重要性。在滴眼給藥毒性試驗中，供試品的最大暴露量不僅出現在（zài）角膜上皮，還（hái）出現在結膜和排泄係統，包括鼻淚管的粘膜和鼻腔。因此，需要特別注意細致檢查這些組織。淚腺、哈（hā）氏腺（若有）、鼻腔和瞬膜（若有）也應進行組織病理學檢查。為了準（zhǔn）確地（dì）進行（háng）組織病理學評估分析，必須嚴格考量組織（zhī）病理切片的質量。如今已有多篇關於這一方麵的文章發表，詳細闡述了（le）切片的（de）各種（zhǒng）技術（shù）考量。